草原家畜生物育种集成攻关大平台成果
特异性靶向绒山羊安全位点Rosa26的sgRNA及其应用
主要完成人：刘东军 张耀光 高源 郝斐 宋卫国
成果完成时间：2022年6月
技 术 领 域：生物科学
申请（专利）号：CN202210941201.6
转 化 方 式：技术转让
成 果 简 介：
本发明首次在山羊上鉴定出安全位点Rosa26的完整序列，并提供了特异性靶向Rosa26位点的sgRNA和利用CRISPR/Cas9系统介导完成定点敲除以及定点整合EGFP基因的应用,通过构建Cas9/gRNA表达载体在细胞、胚胎甚至是个体水平实现了Rosa26位点特异性修饰（敲除或敲入）的目标，从而为研究特定基因的表达情况以及新品种山羊的培育提供技术支持。本发明首先利用生物信息学方法预测出Rosa26位点的完整序列，然后利用sgRNA设计软件及TA克隆测序获得了针对Rosa26位点最优的sgRNA，同时构建了同源整合EGFP基因载体，最后利用筛选出的sgRNA（Cas9/gRNA共表达载体）和同源整合载体（Rosa26-EGFP）同时转染进绒山羊胎儿成纤维细胞，获得了Rosa26位点定点整合EGFP基因的细胞株。本发明的sgRNA能特异识别绒山羊的Rosa26位点，引导Cas9核酸内切酶对该位点进行高效切割，打靶效率可以达到40%以上，能有效减少CRISPR/Cas9系统存在的脱靶现象，进而减少因非特异性切割造成的非目标基因序列的突变。本发明中的安全位点Rosa26及sgRNA可用于山羊疾病治疗、新品种培育、性状改良等。该技术配套条件简单，只需要实验室常用的仪器，如梯度PCR仪、离心机、电转仪、细胞培养箱、荧光显微镜等。
CRISPR/Cas9技术成熟，结合本发明获得的Rosa26位点以及sgRNA,可用于山羊新品种的培育、疾病的治疗、性状的改良，预期经济效益在1000万元以上。
